實(shí)驗(yàn)室PCR 產(chǎn)物的電泳及純化
一、目的
(1)了解PCR產(chǎn)物電泳與純化的原理。
(2)熟悉和掌握PCR產(chǎn)物電泳與純化的操作。
二、原理
在PCR過(guò)程中，部分引物和dNTPs在Taq酶等因子的作用下以DNA模板為指導(dǎo)合成新的DNA分子，當(dāng)然還有一部分的引物和dNTPs沒(méi)有完成所期望的任務(wù),以小分子的形式存在于PCR產(chǎn)物混合液中,為了后續(xù)分子克隆的工作能夠順利進(jìn)行,PCR產(chǎn)物就需要進(jìn)行純化，以去除PCR產(chǎn)物混合液中殘留的Taq酶、BSA、Mgt+、引物dNTPs.buffer中的小分子以及非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。
通過(guò)電泳將所需要的PCR產(chǎn)物和其他分子分離,經(jīng)過(guò)EB染色后，在紫外燈激發(fā)顯色下把目標(biāo)條帶從凝膠中切出來(lái)，然后通過(guò)相應(yīng)的緩沖液將其溶解，經(jīng)異丙醇(乙醇)作用使得DNA分子沉淀，再通過(guò)在高速離心讓沉淀的DNA分子結(jié)(indin)在濾膜上，而后用洗脫緩沖eluton ut其從濾膜上洗脫下來(lái)就得到了純化的PCR產(chǎn)物。
三、買(mǎi)驗(yàn)材料、器材和試劑
1.實(shí)驗(yàn)材料
有目標(biāo)條帶的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
2.實(shí)驗(yàn)器材
①離心機(jī);②2mL離心管;③移液器;④移液槍頭;⑤水浴鍋;⑥手術(shù)刀片;⑦紫外凝膠觀察儀;⑧密封盒;⑨防紫外線眼鏡;?橡膠手套;①分析天平;2離心管架;③1.5mL離心管;④水平電泳槽;⑤電泳儀;①⑥微波爐;⑦藍(lán)蓋試劑瓶;⑧帶有層析濾膜的離心管(QIA quickspincolumn)。
3.實(shí)驗(yàn)試劑
①PCR產(chǎn)物純化試劑盒(QIAGEN);②異丙醇;③瓊脂糖;④6X上樣緩沖液(loading-buffer) ;⑤1X TAE電泳緩沖液;⑥溴化乙錠(EB) ;⑦100bp DNA marker;⑧3M NaAc(pH值為5. 0)。
四、操作方法
(-)瓊脂糖凝膠電泳
1.制膠
準(zhǔn)制腦膠模具，稱取128脂期，倒人藍(lán)蓋試劑瓶中，然后用量簡(jiǎn)量取50mL 1x
TAE電泳緩沖液倒人藍(lán)蓋瓶中。蓋緊瓶蓋，放人微波爐中，中火2~3min,待瓊脂糖wan全熔化后,取出藍(lán)蓋試劑瓶(取時(shí)要戴微波爐手套,以免被燙傷)，于室溫下放置5~8min,將凝膠液緩緩倒入制膠模具中,插上樣品梳，于室溫下靜置20~ 30min。
2.點(diǎn)樣
將凝固好的瓊脂糖凝膠,放人加有電泳緩沖液的水平電泳槽中，取出樣品梳。然后加人15pL有目標(biāo)條帶的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物+1.5pL 6X.上樣緩沖液(Loading buffer)的比例進(jìn)行混合后,把混合溶液加人凝膠的樣品槽中,在合適的樣品槽中加人2μL100bpDNAmarker.
3.電泳
蓋好電泳槽蓋后，接通電源，120V電泳1h 20min左右(在凝膠中只有一排樣品槽的情況)。
4.凝膠染色
電泳完畢后,取出凝膠,放人裝有溴化乙錠的密封盒中，染色25min。
(二)電泳后PCR產(chǎn)物純化
找出電泳結(jié)果出現(xiàn)單一目標(biāo)條帶的對(duì)應(yīng)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化。具體步驟如下:(1)在2.0mL的離心管壁上寫(xiě)上準(zhǔn)備純化的PCR產(chǎn)物的相關(guān)信息,并稱重。
(2)切下含目標(biāo)片段的膠塊，切得盡可能小一些,把所得的膠塊放人2.0mL的離心管中。
(3)稱量裝有膠塊的離心管重量，計(jì)算出膠塊的重量。
(4)加入6倍體積的QG buffer到離心管中(100mg膠相當(dāng)于100pL)。
(5)將含有膠塊的離心管放人50°C水浴鍋中，溫育10min,至膠塊wan全溶解，為促進(jìn)溶解，每2~ 3min振蕩離心管-一次。
(6)膠塊全部溶解后,檢查混合液的顏色是否為黃色(與未溶解之前的QG buffer 的顏色相似,若混合液的顏色為橙色或紫色,加10pL 3M NaAc(pH值為5. 0)。
(7)向離心管中加人1倍凝膠體積的異丙醇,混勻。
(8)將溶液轉(zhuǎn)移人QIA quick spin column中,13 000rpm離心1min。
(9)棄掉液體,加入750μL PE buffer ，靜置2~5min,13 000rpm離心.1min.
(10)棄掉液體,13000rpm離心1min(空載離心，除去乙醇)。
(11)把QIA quick spin column置于一一個(gè)潔凈的1. 5mL的離心管中。
(12)加人30pL的elution buffer置膜中央,13000rpm離心1min。(13)將洗脫所得溶液置于一20°C中儲(chǔ)存。
所得到的洗脫液可與克隆載體進(jìn)行連接，然后轉(zhuǎn)化使重組DNA分子進(jìn)人大腸桿菌細(xì)胞內(nèi),經(jīng)過(guò)培養(yǎng)獲取克隆子。
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