1.什么是RIPA裂解液？
RIPA裂解液（Radio Immunoprecipitation Assay Lysis buffer，放射免疫沉淀法裂解緩沖液）是一種傳統(tǒng)的可用于裂解細胞或組織的快速裂解液，其原理為利用表面活性劑等裂解細胞膜（包括核膜），從組織或細胞中抽取可溶性蛋白。RIPA裂解液裂解后得到的蛋白一般可直接用于常規(guī)的WB、IP、co-IP等實驗。
2.RIPA裂解液里有什么？
RIPA裂解液的配制方法有很多種，主要包括裂解成分、蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑三種組分。裂解成分可通過破壞細胞膜和蛋白間的相互作用等方式裂解組織或細胞；蛋白酶抑制劑可有效抑制各類蛋白酶的活性，避免蛋白過度降解；磷酸酶抑制劑可有效抑制去磷酸化作用。
值得注意的是，由于RIPA裂解液中含有一些穩(wěn)定性相對較弱的酶類抑制劑，故應(yīng)放在-20℃保存。其中PMSF的穩(wěn)定性極弱，半衰期只有0.5 h，所以必須現(xiàn)配現(xiàn)用。
3.如何選擇合適的RIPA裂解液？
如果您只是要做普通的WB、IP或者co-IP，我們建議您使用免疫印跡及免疫沉淀用（WB/IP）裂解液(20118)，該裂解液在裂解細胞或組織后一般不會形成粘滯的透明狀DNA團塊，不必采用超聲處理就可進行下一步操作。同時，該裂解液還適用于磷酸化蛋白的WB檢測。
如果使用免疫印跡及免疫沉淀用（WB/IP）裂解液(20118)的效果不是很好，那您的蛋白可能比較特殊，我們建議您可以嘗試另外幾種裂解液。如果您的蛋白是難溶性的蛋白，建議您可以嘗試使用裂解強度更高的裂解液，如RIPA裂解液(強/中)；如果您在做IP實驗的時候發(fā)現(xiàn)背景很高，即有很多非特異性蛋白被IP下來，這時候您需使用裂解強度較強的裂解液，比如RIPA裂解液(強/中)。反之，如果您發(fā)現(xiàn)目的蛋白無法IP下來，則說明您使用的裂解液強度過強，此時需使用裂解強度較弱的裂解液，比如RIPA裂解液(弱)。
4. RIPA裂解液適用于哪些細胞？
幾乎適用于所有實驗室培養(yǎng)的動物細胞和各種組織。包括各種懸浮細胞、貼壁細胞及動物組織等。
5. 如何判斷細胞的裂解程度？
細胞裂解：加入RIPA后，充分裂解的細胞，沒有細胞沉淀，很粘稠。如果像渾濁的水一樣粘性很小則可能是裂解液得量加太多導(dǎo)致的；相反，如果RIPA裂解液后出現(xiàn)膠狀物體，離心不能沉淀則可能是蛋白太多，RIPA裂解液加入的量太少導(dǎo)致的。
組織裂解：先將組織剪成細小的碎片，之后利用勻漿器或超聲破碎的方法，鏡檢顯示細胞破碎率大于90%，同時組織已經(jīng)wan全裂解，沒有明顯的小組織塊。之后按照細胞裂解的步驟進行裂解，裂解程度的判斷標(biāo)準(zhǔn)與細胞裂解一致。
RIPA裂解液的裂解產(chǎn)物中經(jīng)常會出現(xiàn)一小團透明膠狀物，該透明膠狀物為含有基因組DNA等的復(fù)合物。在不檢測和基因組DNA結(jié)合特別緊密的蛋白的情況下，可以直接離心取上清進行后續(xù)實驗；如果需要檢測和基因組結(jié)合特別緊密的蛋白，則需通過超聲處理打碎打散該透明膠狀物，隨后離心取上清用于后續(xù)實驗。如果檢測一些常見的轉(zhuǎn)錄因子，如NF-κB、p53等時，通常不必進行超聲處理，就可以檢測到這些轉(zhuǎn)錄因子。
6. RIPA儲存出現(xiàn)白色沉淀，為什么？
一般是由于裂解液中SDS在儲存的時候沉淀析出導(dǎo)致，這時只需將裂解液放置于37℃水浴加熱后恢復(fù)室溫即可使用。
7. RIPA裂解液可以獲得細胞中的不同蛋白嗎？
RIPA裂解液提取的是全蛋白，包括核蛋白、漿蛋白、膜蛋白等。如果要提取特定的蛋白（如：核蛋白、膜蛋白）則可利用專門提這類蛋白的試劑盒進行提取。
遠慕在這里給出的建議僅供大家參考，具體裂解液的選擇和使用，還需要根據(jù)您自己的實驗需求和實驗效果選擇適合您實驗的RIPA裂解液。
8.RIPA裂解液的使用方法
如發(fā)現(xiàn)RIPA有沉淀，請放室溫半小時或者常溫水浴使沉淀溶解。
根據(jù)使用量，取每1ml RIPA 加入10ul PMSF，使PMSF的最終濃度為1mM?；靹騻溆?（PMSF現(xiàn)用現(xiàn)加）。
1.樣品前處理：
a)對于貼壁細胞：去除培養(yǎng)液，用 PBS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液洗一遍。按照 6 孔板每孔細胞量加入150-250 ul裂解液的比例加入裂解液。用槍吹打數(shù)下，使裂解液和細胞充分接觸。
b)對于懸浮細胞：離心收集細胞，用手指把細胞用力彈散。按照 6 孔板每孔細胞量加入 150-250 ul 裂解液的比例加入裂解液，再用手指輕彈以充分裂解細胞。充分裂解后應(yīng)沒有明顯的細胞沉淀。如果細胞量較多，必需分裝成50-100萬細胞/管，然后再裂解。
c)對于組織樣品： 把組織剪切成細小的碎片。按照每20mg組織加入150-250 ul裂解液的比例加入裂解液。 (如果裂解不充分可以適當(dāng)添加更多的裂解液，如果需要高濃度的蛋白樣品，可以適當(dāng)減少裂解液的用量)。用玻璃勻漿器勻漿，直至充分裂解。
2.后處理：
將裂解后的樣品10000-14000g離心3-5分鐘，取上清，即可進行后續(xù)的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。
注意事項 ：
強烈型裂解液，可以提取核蛋白，但在提取核蛋白的同時，也會將基因組一并釋放出來，造成細胞裂解液粘稠，此時可以直接加入蛋白上樣緩沖液，煮沸再離心，離心后直接上樣電泳；若想測定濃度，可入加少量 SDS（1%），煮沸后離心測濃度。本系列蛋白提取試劑所提取的蛋白由于含有去污劑，所以不適合使用Bradford蛋白濃度測定試劑盒，請選擇BCA法或者Lowry法檢測蛋白濃度。
